細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)板的操作步驟如下：
1.加樣品：將標(biāo)本稀釋液100ul(或2滴)加到包被板內(nèi)(預(yù)留陰陽(yáng)性及空白對(duì)照2-5孔)，將待檢血清用PBS或生理鹽水按1：20稀釋后取10ul加入反應(yīng)孔內(nèi)。
2.加對(duì)照：加入陰性對(duì)照1-3孔，陽(yáng)性對(duì)照1孔，各100ul對(duì)照血清?？瞻讓?duì)照1孔空置。
3.溫育：將反應(yīng)板震蕩使樣品混勻后，置37℃溫箱或水浴反應(yīng)20分鐘。
4.洗板：用蒸餾水將濃縮洗滌液15ml稀釋至300ml。(1)手洗：將反應(yīng)板孔內(nèi)容物傾出，將洗滌液注滿反應(yīng)孔，放置30秒鐘后用力甩去，如此重復(fù)5次后拍干。(2)機(jī)洗：5次，每孔注入洗滌液200ul或注滿，停留30秒鐘后吸盡拍干。
5.加酶標(biāo)工作液：每孔加入100ul(或2滴)酶標(biāo)工作液，置37℃溫箱反應(yīng)20分鐘后，洗板5次，洗板操作同步驟4。
6.顯色和終止反應(yīng)：將底物A、B液各50ul(或1滴)加到反應(yīng)孔內(nèi)，37℃避光顯色10分鐘。每孔加入終止液50ul(或1滴)混勻終止反應(yīng)。
結(jié)果判定
1.酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)450nm，先用空白調(diào)零，然后測(cè)定各孔OD值;如果選用雙波長(zhǎng)測(cè)定，不必設(shè)置空白對(duì)照孔。
2.當(dāng)陰性對(duì)照平均OD值小于0.08，陽(yáng)性對(duì)照(pc)OD值大于0.30時(shí)，說(shuō)明試劑盒有效且實(shí)驗(yàn)操作正確，否則應(yīng)當(dāng)重復(fù)試驗(yàn)。
3.臨界值(CUT—OFF VALUE)=0.15+陰性對(duì)照平均(NC)OD值(當(dāng)陰性平均OD值小于0.05時(shí)，按0.05計(jì)算;當(dāng)陰性平均OD值大于或等于等于0.05時(shí)按實(shí)際值計(jì)算)。
4.標(biāo)本OD值≤臨界值為陰性，標(biāo)本OD值>臨界值為陽(yáng)性。
常用不同培養(yǎng)板的孔底面積及推薦加液量：不同孔板所加培養(yǎng)液的液面都不宜太深，一般在2-3mm范圍，結(jié)合不同孔的底面積就可算出各培養(yǎng)孔的適宜加液量。若加液量過(guò)多會(huì)影響氣體(氧氣)交換，而且在搬動(dòng)過(guò)程中易溢出造成污染。具體所加細(xì)胞密度依實(shí)驗(yàn)的目的不同靈活掌握。
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