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技術(shù)支持

人抗肌聯(lián)蛋白抗體(TTN)ELISA試劑盒說明書
更新時(shí)間:2016-06-27   點(diǎn)擊次數(shù):2380次
人抗肌聯(lián)蛋白抗體(TTN)ELISA試劑盒說明書
本試劑盒應(yīng)用競爭抑制酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中待測物質(zhì)水平。用純化的抗原包被微孔板,往包被抗體的微孔中同時(shí)加入酶標(biāo)的抗體和待測抗體,被測抗體與酶標(biāo)記抗體對特異性抗原進(jìn)行競爭結(jié)合。經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。待測標(biāo)本濃度越高,標(biāo)記抗體和抗原的結(jié)合就越受到抑制,顯色愈淺。顯色的深淺與酶量呈正相關(guān),而與樣品中待測物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計(jì)算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制 
1.         酶聯(lián)板:一塊(96孔) 
2.        標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品):2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,其濃度為100pmol/ml,做系列倍比稀釋后,分別稀釋100 pmol/ml, 50 pmol/ml,25 pmol/ml,12.5pmol/ml, 6.25 pmol/ml,3.12 pmol/ml,1.56 pmol/ml,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0pmol/ml,臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制50 pmol/ml標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 100pmol/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
3.        樣品稀釋液:1×20ml/瓶。
4.        檢測稀釋液A:1×10ml/瓶。
5.        檢測稀釋液B:1×10ml/瓶。
6.        檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(100ul/孔),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
7.        檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.         底物溶液:1×10ml/瓶。
9.        濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
10.     終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。 
標(biāo)本的采集及保存 
1.        血清:全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 xg離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.        血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 xg離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.         其它生物標(biāo)本:請1000 xg離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周,-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,-20℃不應(yīng)超過3個(gè)月,-80℃不應(yīng)超過6個(gè)月;標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測;高血脂的標(biāo)本不需進(jìn)行特殊處理,可直接檢測。
 
操作步驟
實(shí)驗(yàn)開始前,請?zhí)崆芭渲坪盟性噭?;試劑或樣品稀釋時(shí),均需混勻,混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí),均應(yīng)用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實(shí)驗(yàn)室在操作前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以建立*稀釋倍數(shù)。
1.        加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?00ul,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2.        棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(在使用前一小時(shí)內(nèi)配制),37℃,60分鐘。
3.        溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。 
4.        每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul,37℃,60分鐘。
5.        溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
6.        依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。
7.        依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng),此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.        用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測。
注:
1.        每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔(不同于空白孔),該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。
2.        嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑。
3.        洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,避免酶標(biāo)板長時(shí)間處于干燥狀態(tài)。
4.        消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。
5.        在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
6.        未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,請配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時(shí),一次不要小于10ul),以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差;檢測液A、B,以及底物溶液在使用前,應(yīng)置于37℃溫育30分鐘;請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
7.        建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
 
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水
紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需
要,重復(fù)此過程數(shù)次。
自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
特異性
    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人抗titin抗體,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計(jì)算
 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)),OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,如curveexpert1.3),根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng)
1.        洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。
2.        一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。
3.        請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。
4.        如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計(jì)算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5.        在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時(shí),請以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。
6.         底物請避光保存。
檢測范圍:1.56 pmol/ml - 100 pmol/ml
zui低檢測限:0.78 pmol/ml
說明 
1.         在儲(chǔ)存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。
2.         小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。請注意在吸取標(biāo)本 /標(biāo)準(zhǔn)品,酶結(jié)合物或底物時(shí),*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)孵育”時(shí)間,從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。而且,洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果。
3.         試劑盒保存:部分試劑保存于-20℃,部分試劑保存于2-8℃,具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。
4.         濃洗滌液會(huì)有鹽析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。 
5.         剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。 
6.         中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處,請以英文說明書為準(zhǔn)。
7.         所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
8.         有效期:6個(gè)月

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