人維生素D(VD)ELISA檢測試劑盒使用說明書
更新時間：2016-04-18 點擊次數(shù)：2971次
人維生素D(VD)ELISA檢測試劑盒使用說明書
檢測原理:試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被維生素D(VD)抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的維生素D(VD)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法:
1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3.細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5.保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1.37℃恒溫箱
2.酶標儀(450nm)
3.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
操作注意事項
1.試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
2.實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封(低溫干燥)保存。
3.濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，zui終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。
4.嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
5.所有液體組分使用前充分搖勻。
人維生素D(VD)ELISA檢測試劑盒組成:
名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標板12 孔×8 條12 孔×4 條無
標準品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無
樣本稀釋液6mL 3mL 無
檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進行稀釋
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液6mL 3mL 無
封板膜2 張2 張無
說明書1 份1 份無
自封袋1 個1 個無
注：標準品(S0-S5)濃度依次為：0、3、6、12、24、48 ng/mL
試劑的準備:20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1:20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
1.自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
2.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
操作步驟:
1.從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min 內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷:繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。
試劑盒性能:
1.準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值，大于等于0.9900。
2.靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0 ng/mL。
3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應。
4.重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
5.貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.有效期：6個月
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